INTRODUCCIÓN

En las últimas cinco décadas, la prevención del cáncer de cuello de útero (CC) ha progresado eficazmente gracias a los avances en el conocimiento de su causa, efecto, desarrollo, diagnóstico y prevención1^,2.

Elvirus del papiloma humano (VPH) es la principal infección de transmisión sexual (ITS) y es responsable del desarrollo de lesiones precursoras de CC en casos de infección vírica persistente de genotipos oncogénicos de alto riesgo. Los genotipos de alto riesgo 16 y 18 son responsables del 70% de los cánceres y lesiones precancerosas de cuello uterino. El virus VPH tiene tropismo por el epitelio escamoso y las mucosas, y afecta al tracto genital inferior y a la orofaringe3^,4,5,6,7.

En Brasil, el sistema de cribado del CC incluye la detección precoz del virus VPH y un programa de vacunación contra los principales tipos virales que pueden causar la neoplasia4^,8.

En Brasil, el cáncer de cuello uterino es el tercer tipo de cáncer más frecuente entre las mujeres. Para el año 2022, se han estimado 16.710 nuevos casos, lo que representa un riesgo de 15,38 casos por cada 100.000 ^mujeres9. En el análisis regional, el cáncer de cuello de útero es el primero más incidente en el Norte (26,24/100.000) y el segundo en el Nordeste (16,10/100.000) y Centro-Oeste (12,35/100.000). En el Sur (12,60/100.000) ocupa el cuarto lugar y en el Sudeste (8,61/100.000) ^{el quinto10}. En Brasil, la tasa de mortalidad por cáncer de cuello uterino, ajustada a la población mundial, fue de 4,60 muertes/100.000 mujeres en 2020. En la serie histórica de las tasas de mortalidad en Brasil y sus regiones, se observa que las tasas más elevadas del país se han registrado en el Norte, con una clara tendencia al alza a lo largo del tiempo entre 2000 y ²⁰¹⁷¹¹.

Durante muchos años, en Brasil, la metodología principal utilizada en el programa de cribado recomendado fue la citología oncótica o la prueba de Papanicolaou9^,12. Los programas organizados de cribado del cáncer de cuello de útero en los países desarrollados, que utilizan la citología oncótica, han mostrado una reducción significativa de la incidencia de la enfermedad y de la mortalidad en comparación con los ^países en vías de ^desarrollo13.

Los cambios en las recomendaciones de cribado a nivel mundial han sido significativos en la última década, debido a la evidencia de regresión de los resultados citológicos anormales en la gran mayoría de los casos, ya que siguen produciéndose muchas muertes al año por CC, incluso entre las mujeres que han sido objeto de seguimiento, lo que indica que el método ha fracasado. Entre las razones están los resultados falsos negativos (FN), debidos sobre todo a errores en la toma de muestras celulares, fijación inadecuada del material, informes clínicos insuficientes y errores de ^análisis14.

La Organización Mundial de la Salud (OMS), así como Canadá, Francia e Irlanda, recomiendan las pruebas de genotipado del VPH como método principal de cribado del CC, debido a su mayor eficacia en la reducción de la incidencia y la mortalidad en comparación con ^{la citología15}.

Las pruebas de detección del ADN del VPH mediante metodologías moleculares son más sensibles que la citología oncótica y constituyen un método no invasivo, fácil de recoger y que permite identificar el virus. Las pruebas moleculares asociadas a pruebas morfológicas se han propuesto y adaptado en varios países desarrollados para la prevención y el cribado de neoplasias, aumentando la eficacia de los programas de cribado, ya que detectan precozmente lesiones de alto riesgo en mujeres de 30 años o más con citología NILM, y reduciendo la necesidad de coloscopias y tratamientos innecesarios en pacientes de 21 años o más con citología ASC-US5^,6,7.

Los programas de cribado para la detección precoz del CC y de las lesiones precursoras son fundamentales para el control y la prevención de la enfermedad, por lo que recientemente en Brasil, una nueva directriz – Ordenanza SECTICS/MS nº 3 de 07 de marzo de 2024, publicada en el Diario Oficial de la Unión ¹⁶ – estableció el uso de pruebas moleculares para la detección del virus VPH oncogénico de alto riesgo en el cribado del cáncer de cuello uterino, con el fin de mejorar el sistema de identificación del virus en la población y sus consecuencias. Así, en el ámbito del Sistema Único de Salud – SUS, se recomendó el uso de pruebas moleculares para la detección del VPH oncogénico, mediante técnica de amplificación de ácidos nucleicos basada en PCR, con genotipado parcial o ampliado para el cribado del cáncer de cuello de útero en población de riesgo estándar y de acuerdo con las Directrices del Ministerio de Salud. Las directrices de cribado de la citología vaginal recomiendan que la prueba se realice cada tres años y, si se detecta una lesión, anualmente, mientras que las pruebas moleculares se recomiendan cada cinco ^años15. Este cambio permite una mejor adherencia, facilitando el acceso a la prueba a todas las mujeres.

Citología Líquida y Biología Molecular

En la década de 1990 surgieron varias metodologías innovadoras de citología de base líquida (CBL), que mejoraron la metodología convencional de citología oncótica desarrollada en la década de 1940 por la doctora Georgia Papanicolaou y que no se ha modificado desde ^{hace años17}. Esta mejora de la metodología permitió aumentar la precisión, sensibilidad y especificidad de la prueba. La forma de recoger la prueba ha cambiado: en lugar del frotis tomado directamente en el portaobjetos, en el que la espátula se desecha con toda la representatividad significativa de las células recogidas, en la citología líquida, el frotis cérvico-vaginal se introduce en un medio líquido que conserva todas las células en las que se recogió. En el medio líquido, se homogeneiza el cepillo y se lavan las células, lo que permite preparar portaobjetos que contienen células concentradas en un área de 20 mm, con una reducción de la superposición celular ¹⁷. La CML permite que las células permanezcan en el portaobjetos en una capa fina, sin superposición, lo que facilita la lectura de los portaobjetos y proporciona una mejor visualización al eliminar elementos oscuros como la sangre, el exudado inflamatorio, los restos menstruales y el moco18^,19,20.

Muchos estudios han demostrado que la evolución de la metodología convencional a la líquida ha permitido reducir los casos falsos negativos del 5,6% en CC al 2,2% en CML ²¹.

El objetivo de las nuevas tecnologías de preparación del portaobjetos y de los medios de conservación líquidos existentes en el mercado es mantener la estabilidad y la morfología celular intacta, para un análisis excelente y una reducción considerable de la presencia de interferentes, optimizando la mayor capacidad de detección de lesiones precancerosas en comparación con la citología convencional. Esta dilución del cepillo celular recogido ha permitido ampliar otros análisis a partir de la misma colección, lo que aporta un escenario de nuevas oportunidades e investigaciones moleculares en beneficio de la paciente y su salud ^19,20,21,22.

Los conservantes de la citología líquida permiten que las células recogidas permanezcan viables para el análisis durante más tiempo, en comparación con el frotis de un portaobjetos de citología convencional, que debe teñirse tras su preparación. La CML permite hacer otros portaobjetos para confirmar un resultado discordante o hacer un nuevo portaobjetos en caso de errores o problemas preanalíticos, como que el material se rompa o se pierda, sin tener que volver a llamar al paciente para una nueva recogida19^,20,21,22.

Con la nueva Ordenanza SECTICS/MS nº 3 de 7 de marzo de 2024, publicada en el Diario Oficial de la Federación, la recogida de citología en medio líquido, en comparación con la citología convencional, ayudará al genotipado del VPH como prueba de cribado primario, además de posibilitar el uso de la citología refleja, evitando que las mujeres con VPH de alto riesgo positivo, durante el cribado preventivo, tengan que volver al servicio sanitario para una nueva recogida con fines de cribado citológico16^,23,24,25.

Los conservantes colectores disponibles y utilizados en los ensayos moleculares, antes de la mejora de la citología de base líquida, no se desarrollaron con el fin de conservar la morfología celular; se diseñaron sólo para la conservación del material genético, ADN y/o ARN. Estos conservantes lisaban las membranas celulares para preservar y conservar sólo el material genético a temperatura ambiente y, posteriormente, incluso durante más tiempo en ^{refrigeración26}.

Con la aparición en el mercado de nuevos conservantes para la LMC, que preservan la morfología celular y, en consecuencia, el material genético, su aplicabilidad en los ensayos moleculares ha demostrado ser un factor beneficioso e importante para ampliar la investigación de las enfermedades relacionadas con las patologías del tracto genital inferior. La homologación de los medios líquidos específicos para la detección del virus del VPH y de las ITS ha facilitado la realización de la prueba primaria de cribado del CC, así como de pruebas moleculares de la misma representatividad celular a partir de una única colección ^18,19.

Con la aparición de distintos tipos de conservantes en el campo de la citología oncológica de base líquida, han sido necesarias validaciones analíticas que han progresado en los laboratorios según sus necesidades y el uso de los kits. Las principales plataformas moleculares han realizado validaciones con medios conservantes de LMC, con el objetivo de desarrollar protocolos con las mismas prestaciones que los colectores habituales aprobados inicialmente. Los protocolos desarrollados priorizaron inicialmente tres puntos relevantes para mantener los estándares analíticos de sus tecnologías: el primero era mantener la concentración celular inicial, mediante pasos de centrifugación con una concentración previa, ya que ambos colectores tenían volúmenes iniciales diferentes, los de ensayos moleculares tenían 1 ml y los de CML de 10 a 20ml. El segundo paso era romper las membranas celulares que se conservaban en los conservantes de la CML, por lo que el siguiente paso era la desnaturalización térmica y/o el cambio de pH. El tercer paso era identificar si la composición química de los conservantes podía interferir con las reacciones moleculares, provocando inhibiciones de la reacción y conduciendo potencialmente a resultados insatisfactorios o erróneos23^,24,25.

La concentración y los componentes presentes en diversos kits de recogida son factores importantes en la calidad del producto final cuando se utiliza con fines moleculares. Se ha demostrado que los medios líquidos a base de metanol conservan la estructura morfológica, además de permitir mantener la estructura molecular sin interferencias de reacción. Se ha demostrado que muchos medios de recogida de LMC con formaldehído en su composición interfieren significativamente en la estructura molecular de la célula, lo que dificulta el uso eficaz de estas recogidas para investigaciones moleculares. La formalina se utiliza ampliamente como conservante morfológico, pero favorece la reticulación del ADN del VPH entre otras dianas y proteínas nucleares, lo que se conoce como reticulación, que dará lugar a la fragmentación del ADN y causará interferencias en la amplificación por PCR, reduciendo la sensibilidad del ensayo y la posibilidad de resultados falsos negativos27^,28.

El Sistema de Citología Líquida Kolplast CellPreserv Colector del Sistema de Citología Líquida ha sido sometido a validación molecular en laboratorios privados y públicos, que comprenden diversas plataformas de Biología Molecular. Su composición a base de metanol proporciona al medio conservante un rendimiento adecuado para la carga directa en pruebas de PCR en tiempo real, sin necesidad de tratamientos previos para eliminar componentes como el formol. Su composición ha demostrado, en diversos estudios, un óptimo rendimiento analítico, sin causar interferencias y/o inhibición de sus componentes químicos conservantes en las reacciones de PCR en tiempo real, además de permitir la recogida y transporte del material a temperatura ambiente, sin necesidad de refrigeración previa ²⁹.

El medio líquido CellPreserv Kolplast demuestra alta estabilidad, preservación de la morfología celular y del material genético de las muestras, excelente rendimiento para pruebas moleculares y ayuda eficazmente a aumentar la capilaridad en la realización de pruebas preventivas, facilitando las medidas de gestión y cribado del cáncer de cuello de útero en la población de riesgo, según las Directrices del Ministerio de Sanidad.

El objetivo de este estudio era evaluar el rendimiento del medio líquido CellPreserv Kolplast para ensayos moleculares de detección del virus VPH.

CASUÍSTICA Y MÉTODO

Cincuenta especímenes de cepillados cérvico-vaginales, recogidos del medio líquido CellPreserv Kolplasten el laboratorio privado IPOGLab – São Paulo/Brasil. Todas las muestras se analizaron mediante técnicas moleculares consideradas el patrón oro para los tipos de VPH oncogénicos de alto riesgo.

Las metodologías moleculares probadas fueron Hybrid Capture 2v2 ³⁰, para el grupo de VPH oncogénicos de alto riesgo (tipos: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68) ^(QIAGEN®) con una sensibilidad analítica de 1 pg/ml o 5.000 copias virales, y el ensayo de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) en tiempo real mediante el sistema Cobas 4800 ^(ROCHE®)31 con genotipado específico del VPH de alto riesgo oncogénico: VPH 16 y VPH 18 y para el grupo en su conjunto: 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 y 68, con una sensibilidad analítica de 50 copias virales. Ambas pruebas se realizaron en el laboratorio IPOGLab de São Paulo.

En ambas metodologías se siguieron los protocolos de carga desarrollados para el medio líquido PreservCyt ^(HOLOGIC®).